Multifunctional anti-cancer nanocarriers to improve therapy and reduce cardiotoxicity

Towards improved cancer therapy using drug carriers and new active moleculesCancer is the second leading cause of death globally and there is a need of better treatment methods.The overall aim of my phd is to develop cancer therapy which are milder to patients, using drug carriers and new active molecules.Nanoparticles are passively targeted to the tumour by the enhanced permeability and retention (EPR) effect. However, there are several obstacles including high interstitial fluid pressure (PIF) and large variation between tumours. Consequently, manipulation of the tumour microenvironment would be critical to improve nanoparticle delivery. The aim of the first paper was to prime tumours to increase uptake of nano particles using the cAMP receptors PKA and Epac1. We have completed an animal study were we found that lack of Epac1 causes the mice to have 60% higher interstitial pressure in the tumour compared to WT mice. Administration of cAMP stimulating agents lowered tumour PIF similarly in both genotypes. Furthermore, mice without Epac1 do not have a changed nanoparticle accumulation in the tumour compared to WT mice. In conclusion, modulation of cAMP receptors by pharmacological modulators does not appear to be a viable method to augment the EPR effect. Other means of manipulating the endothelial barrier must be investigated. The results from this project har been analysed, we have made figures, and the paper has been written during 2020. Next, a major limitation of antracycline treatment is cardiotoxicity, and production of reactive oxygen species (ROS) is discovered to be important. Nanoparticles with antracyclines are available, but they are not good enough to replace the use of free antracyclines. Statins is a group of drugs found to be cardioprotective. The aim of this paper was to reduce antracycline induced cardiotoxicity by co-loading of doxorubicin (DOX) and statin in liposomes, securing delivery of the protective statins at the site of toxicity. We have demonstrated co-encapsulation of DOX and statisn, at high concentrations. Statins do not inhibit the toxic effect of DOX when used in co treatment of cancer cell lines. It rather seem to have an synergistic effect at certain concentrations in both MCF-7 breast cancer cells and in PC3, a prostate cancer cell line. Cell-viability were analysed by Wst-1 and hoecst staining. The Wst-1 assay is based on the cleavage of WST-1 to formazan by cellular mitochondrial dehydrogenases. The larger the number of viable cells, the higher the activity of the mitochondrial dehydrogenases, and in turn the greater the amount of formazan dye formed. Hoechst staining the nuclei of living or fixed cells and tissues, allowing to detect viable and non-viable cells. We analysed ROS production in cardiomyoblasts using the probe DCFDA assay, which is based on the diffusion of DCFDA into the cell were it is deacetylated by cellular esterases, and later oxidized by ROS into 2’, 7’ –dichlorofluorescein being highly fluorescent. The results revealed a marked increase in ROS in response to DOX treatment. When cells were pretreated with statins the DOX induced ROS productions were lowered. ROS was also formed in MCF-7 cells in response to DOX treatment, but it was not affected by statin co-treatment. Our lab has established a zebra fish model allowing for micro injection of substances into the cardinal vein of zebrafish larvae up to 5 days post fertilisation. The microscope and a camera allow for monitoring of the effect by heart rate and contraction. We have and will continue to study how statins can retain cardiac function in larvae treated with doxorubicin. Preliminary test shows reduced heart rate in response to DOX, a change that were not observed when the zebrafish larvae were pre-treated with statin.

Towards improved cancer therapy using new molecules and drug carriers.Nye behandlinger og nye aktive stoffer er nødvendig for å bedre kreftbehandlingen. Cytostatika har vært gunstig i kampen mot kreft, men høy toksisitet begrenser behandling grunnet alvorlige bieffekter. Dette prosjektet vil utvikle nye og mildere behandlingsmåter, ved bruk av nano-bærere, og nye aktive stoffer.Prosjektet har tre deler: I) Vi ville undersøke mekanismer i tumoren som kan manipuleres for å potensielt øke opptak av nanopartikler i kreftsvulster. Vi har valgt et system av proteiner som er regulert av cAMP, nemlig PKA og Epac. PKA og Epac er involvert i signalomforming og regulerer flere funksjoner innen endotelbarriereintegritet, proliferering og migrering. Aktiviteten kan være overlappende, ulik, eller til og med antagonistisk. Vi har fullført et dyrestudie som viser hvordan vi kan senke trykket i brysttumorer hos mus, og at mus uten Epac1 ikke har en endret akkumulering av nanopartikler i tumor sammenliknet med villtype musene. Dette støttes av at vi ikke fant noen forskjell i mellomrommene mellom endotelcellene i tumorene til mus uten Epac1 og villtype mus. Videre fant vi at mangel på Epac1 gjør at musene har et høyere interstitielt trykk i tumor. Behandling med cAMP-stimulerende stoffer viser at reduksjon i trykk i tumor er styrt av PKA heller enn via Epac1. II) Vi har utviklet to multifunksjonelle liposomale formuleringer med cellegiften doxorubicin og kardioprotektivt statin. Den ene formuleringen har begge legemidlene som fri substans, mens den andre har statin koblet til fosfolipidene i lipidmembranen til liposomene. Vi har oppnådd høy konsentrasjon av begge legmidlene, og teste nå ut om disse liposomene beskytter hjerteceller mot frie oksygenradikaler (ROS) indusert av cellegiften doxorubicin. ROS er tenkt å være hovedmekanismen bak kardiotoksisiteten indusert av doxorubicin og lignende cellegifter (antracykliner). Vi har studert og vil fortsette å studere effekten av disse nanoformuleringene på ROS-produksjon. Vi har brukt ROS-proben DCFDA. Vi vil fortsette disse studiene og inkluderer biosensorer for åmåle hydrogenperoksyd (H2O2) direkte. Vi har også etablert en sebrafisklarvemodell der vi kan mikroinjisere liposomer i hjertevenen for å visualisere effekten av våre multifunksjonelle liposom i et intakt hjerte. III) Dette delprosjektet inkluderte evaluering av et sett kinase-inhibitorer for anti-AML (akutt myeloid leukemi) effekt. Ett av stoffene (VS-II-173) induserte selektivt celledød i AML celler sammelignet med normale celler. En evaluering av effekt mot 50 kinaser viste at VS-II-173 var aktiv mot flere av kinasene involvert i utvikling av AML, deriblant PIM kinase 1, 2 og 3, AMPK og DYRK1A. VS-II-173 viste ingen effekt mot kinaser som PKA og PKC og er ikke en generell kinase-inhibitor. VS-II-173 var mer aktiv mot AML- cellelinjene vi har testet sammenliknent med spesifikke kinaseinhibitorer for PIM kinase, potensiellt grunnet at VS-II-173 er aktiv mot flere kinaser. VS-II-173 viste tydelig synergi i kombinasjon med Dauanorubicin som er standard cytostatika brukt i AML behandling. Videre viste det seg at VS-II-173 var cytotoksisk for AML pasient blaster, inkludert blaster med høyrisiko FLT3-ITD mutasjon.

Multifunctional anti-cancer nanocarrierrokveld therapy and redusert cardiotoxicityDet er behov for nye behandlinger og nye aktive stoffer for å bedre behandlingen av kreft. Cytostatika har vært gunstig i kampen mot kreft, men kraftige bivirkninger begrenser behandlingen. I dette prosjektet vil vi forsøke å utvikle mildere behandlingsmåter ved bruk av nano-bærere, eller ved bruk av en mer målrettet terapi.Prosjektet er delt inn i tre delprosjekt: I) Det første delprosjektet er å vurdere et sett med substanser som hemmer overlevelses-proteinet PIM. Denne kinasen er spesielt viktig for overlevelse og proliferasjon av akutt myeloid leukemi (AML). Vi har funnet at PIM kinase inhibitoren VS-II-173 selektivt induserer celledød i AML celler sammelignet med normale celler. Inhibitoren viste tydelig synergi i kombinasjon med Dauanorubicin som er standard cytostatika brukt i AML behandling. Videre viste det seg at VS-II-173 var cytotoksisk for AML pasient blaster. Dette er blitt publiser nå i januar 2019. II) Dette delprosjektet handler om å finne ut mekanismer i tumoren som kan manipuleres slik at vi får økt opptak av nanopartikler i kreftsvulster. Vi har valgt et system av proteiner som er regulert av cAMP, nemlig PKA og Epac. De er involvert i signalomforming og regulerer flere funksjoner innen endotelbarriere integritet, proliferering og migrering. Vi har fullført en dyrestudie som viser hvordan vi kan senke trykket i brysttumorer hos mus, og for å studere distribusjonen av nanopartikler i mus med eller uten kreft-svulster. Mus uten Epac1 har ikke en endret nanopartikkelakkumulering i tumor sammenliknet med normale mus. Dette støttes av at vi ikke fant noen forskjell i mellomrommene mellom endotelcellene i tumorene til musene. Videre fant vi at mangel på Epac1 gjør at musene har et høyere interstitielt trykk i tumor. Behandling med cAMP stimulerende stoffer viser at reduksjon i trykk i tumor er styrt av PKA enn via Epac1. III) Multifunksjonelle liposomer til forbedret kreftterapi. Vi har utviklet to ulike liposomale formuleringer med cellegiften doxorubicin og kardioprotektivt statin. Den ene formuleringen har begge legemidlene som fri substans, mens den andre har statin koblet til fosfolipidene i lipidmembranen til liposomene. Vi har oppnådd høy konsentrasjon av begge legmidlene, og teste nå ut om disse liposomene beskytter hjerteceller mot frie oksygenradikaler indusert av cellegiften doxorubicin. Disse oksygenradikalene er tenkt å være hovedmekanismen bak kardiotoksisiteten indusert av doxorubicin og lignende cellegifter (antracykliner). Dette er et doktorgradsprosjket hvor bruekrmedvirkning ikke vil bli aktuellt. Vi tror prosjektet i vil bidra til at kreftbehandling i fremtiden vil bli bedre ved å bidra til økt forståelse av akkumulering av legemiddel i tumorer, ved identifisering sv nytt anti-leukemisk stoff og ved utvikling av nye liposomformuleringer som reduserer bivirkninger og hindrer resistens.

Multifunctional anti-cancer nanocarriers to improve therapy and reduce cardiotoxicityNye behandlinger og nye aktive stoffer er nødvendig for å bedre en kreftdiagnose. Cytostatika har vært gunstig i kampen mot kreft, men høy toksisitet begrenser behandling grunnet alvorlige bieffekter. Dette prosjektet vil utvikle nye og mildere behandlingsmåter, ved bruk av nano-bærere, eller målrettet terapi.I) Dette delprosjektet handler om å finne ut mekanismer i tumoren som kan manipuleres slik at vi får økt opptak av nanopartikler i kreftsvulster. Vi har valgt et system av proteiner som er regulert av cAMP, nemlig PKA og Epac. PKA og Epac er proteiner involvert i signalomforming og regulerer flere funksjoner innen endotelbarriere integritet, proliferering og migrering. Aktiviteten til deres kan være overlappende, ulik, eller til og med antagonistisk. Vi har fullført et dyrestudie som viser hvordan vi kan senke trykket i brysttumorer hos mus, og for å studere distribusjonen av nanopartikler i mus med eller uten kreft-svulster. Disse har vist at mus uten Epac1 ikke har en endret akkumulering av nanopartikler i tumor sammenliknet med villtype musene. Dette støttes av at vi ikke fant noen forskjell i mellomrommene mellom endotelcellene i tumorene til mus uten Epac1 og villtype mus. Videre fant vi at mangel på Epac1 gjør at musene har et høyere interstitielt trykk i tumor. Behandling med cAMP stimulerende stoffer viser at reduksjon i trykk i tumor er styrt av PKA heller enn via Epac1. II) Multifunksjonelle liposomer til forbedret kreftterapi. A. Vi har utviklet to ulike liposomale formuleringer med cellegiften doxorubicin og kardioprotektivt statin. Den ene formuleringen har begge legemidlene som fri substans, mens den andre har statin koblet til fosfolipidene i lipidmembranen til liposomene. Vi har oppnådd høy konsentrasjon av begge legmidlene, og teste nå ut om disse liposomene beskytter hjerteceller mot frie oksygenradikaler indusert av cellegiften doxorubicin. Disse oksygenradikalene er tenkt å være hovedmekanismen bak kardiotoksisiteten indusert av doxorubicin og lignende cellegifter (antracykliner). B. Den siste delen av mitt prosjekt er å forsøke å nedregulere uttrykking av faktorer sentrale i behandlingsresistens i AML ved bruk av nano-bærere med siRNA. Her er et introduksjonsforsøk gjort hvor vi har sett på om nanopartikler med siRNA for GFP nedregulerte GFP-signalet i Molm-13 celler som uttrykker GFP ved bruk av Flow-analyse. III) Det første delprosjektet er å vurdere et sett med substanser som hemmer overlevelses-proteinet PIM. Denne kinasen er spesielt viktig for overlevelse og proliferasjon av akutt myeloid leukemi (AML). Vi har funnet at PIM kinase inhibitoren VS-II-173 selektivt induserer celledød i AML celler sammelignet med normale celler. Inhibitoren viste tydelig synergi i kombinasjon med Dauanorubicin som er standard cytostatika brukt i AML behandling. Videre viste det seg at VS-II-173 var cytotoksisk for AML pasient blaster. Vi har sendt inn et manuskript som beskriver dette arbeidet og våre resultater, og arbeider nå med en revisjon som skal sendes inn i starten av mars.

Multifunctional anti-cancer nanocarriers to improve therapy and reduce cardiotoxicityVi ønsker med dette prosjektet å øke forståelsen av hvordan nanopartikler kan benyttes terapeutisk i kreftterapi og å utvikle nanopartikler for personifisert medisin, noe som fremstår som avgjørende for vellykket kreftbehandling i fremtiden. Prosjektet er delt opp i fire deler.I) Vi ønsker å undersøke mekanismene som fører til at legemidler og nanopartikler akkumulerer i tumorer ved å studere de to cAMP effektorene PKA og Epac1 i mammary carcinom. Det er tidligere blitt funnet at lekasje i en tumors blodkar leder til akkumulering av nanopartikler i tumor mer enn i organer. Vi har funnet at denne akkumuleringen ikke påvirkes av trykk i tumoren.Tidligere funnet ut at en sterk intracellulært cAMP økning senker nanopartikler opphopning i Epac1 knockout mus, men ikke i villtype mus. Dette indikerer at Epac1 er viktig i å regulere endotel barriere, og at PKA og Epac1 virker sammen for å finjustere denne barrieren, og dermed bli potensielle mål. Videre har vi funnet tegn på at transport gjennom cellene i blodkarene er viktigere for akkumuleringen, heller enn transporte mellom dem. II) Cytostatika har vært gunstig for behandling av tumorer, men mangel på selektivitet er et stort problem, som leder til toksisitet på normale celler og vev. Vi har forsøkt å utvikle multifunksjonelle nanopartikler med redusert kardiotoksisitet ved å innkapsle anthracyclinet doxorubicin og det kardiobeskyttende medikamentet statin i samme partikkel. Det er to måter dette kan gjøres på som vi nå stester. Den første er å lage et liposom som har statiner inkudert i lipidmembranen som så fylles med doxorubicin som vi har oppnådd god inkudering av både doxorubicin og statin. Den andre måten er å syntetisere et "pro-drug" av statin. Dette "pro-druget" vil kunne inkluderes i membranen og vil bli kløyvet av etter at liposomene er blitt tatt opp av cellene. Disse liposomene vil bli testet på hjerteceller in vitro og etterhvert også i dyr. III) siRNA kan brukes for å hemme genuttrykket av spesifikke gener. Vi skal bruke nanopartikler som bærere av siRNA for å hemme uttrykket av proteiner forbundet med dårlig prognose for å reetablere kjemosensitivitet i resistente leukemiceller. Dette vil få mer fokus etter sommeren 2017. IIII) En fjerde del som skal bli en del av mitt doktorgradsprosjekt er å se på nye substansar med potensiale for bruk som nye typer cellegift. Vi har funnet veldig god effekt med en hemmer av "overlevelseskinasen" PIM-kinase i leukemiceller. PIM-kinase er sentralt i utvikling av resistens i leukemi. Testene vi har gjort viser at hemmeren har synnergi med flere cytostatika. Dette undersøker vi videre ved å se på hvordan viktige signalveier i kreftcellene er påvirket.