Single cell immune and signaling profiles in steroid-refractory acute graft-versus-host disease (aGVHD).

Enkeltcelleanalyser ved allogen stamcelletransplantasjon, med fokus på transplantat-mot-vert sykdom (GVHD)Vi har det siste året videreført innsamling av blodprøver fra pasienter som gjennomgår allogen stamcelletransplantasjon, og etter kompletterende metodetesting gjort analyser av utvalgte pasientprøver med sikte på å bedre forståelsen av biologiske prosesser ved GVHD, især ved steroidrefraktær sykdom.Ved allogen hematopoietisk stamcelletransplantasjon overføres blodstamceller fra en frisk giver til en syk pasient, for å helbrede sykdommen og gjenopprette et friskt blod- og immunsystem. Denne behandlingen står sentralt ved flere alvorlige sykdommer, særlig ved akutt blodkreft (leukemi). I Norge transplanteres om lag 170 voksne pasienter hvert år, fordelt på 2 transplantasjonssentre i hhv. Oslo (Rikshospitalet) og Bergen (Haukeland Universitetssykehus). Hos mange av pasientene oppstår komplikasjonen transplantat-mot-vert sykdom (ofte forkortet GVHD, for ´graft-versus-host disease´), hvor celler fra giver setter i gang en immunreaksjon mot pasientens organer og vev. Slike reaksjoner behandles vanligvis med steroidmedikamenter, og hvis disse ikke virker, kaller vi sykdommen steroidrefraktær. Dette er ofte svært alvorlig, ettersom andre behandlingsmuligheter er begrenset og effekten uforutsigbar. Vårt prosjekt undersøker blodceller fra transplanterte pasienter over tid med metoden massecytometri, som gir en unik mulighet til å måle nesten 50 ulike molekyler inni – og utenpå den enkelte celle, samtidig. Vi ønsker også å kartlegge enkeltcellers genuttrykk samt viktige signalproteiner (cytokiner) i blodet til de samme pasientene, og se på sammenhengen mellom de ulike måleresultatene. Dette kan gi mer detaljert kunnskap om de biologiske prosessene ved stamcelletransplantasjon, med fokus på GVHD og behandlingseffekter. I neste omgang håper vi dette kan bidra til utvikling av nye biomarkører og behandlingsprinsipper. Prosjektets fremdrift har vært påvirket og forsinket av bl.a. COVID-pandemien, men arbeidet med innsamling av pasientprøver er videreført også siste år. I tillegg er det gjennomført kompletterende testing og finjustering av vårt analysepanel for massecytometri, før vi gikk videre med et oppskalert forsøk på drøyt 100 utvalgte pasientprøver. Analyse av de samlede resultatene fra dette forsøket er for tiden pågående, og forventes å danne grunnlag for publikasjon. Vi planlegger fortsatt også massecytometrisk analyse av vevsprøver/-snitt fra stamcelletransplanterte pasienter, samt ytterligere validering med analyse av signalstoffer i blod samt enkeltcelle RNA-sekvensering.

Enkeltcelleanalyser ved allogen stamcelletransplantasjon, med fokus på transplantat-mot-vert sykdom (GVHD)Vi har det siste året videreført innsamling av blodprøver fra pasienter som gjennomgår allogen stamcelletransplantasjon, samt testet og utviklet våre analysemetoder ytterligere med sikte på å bedre forståelsen av biologiske prosesser ved GVHD, og især ved steroidrefraktær sykdom.Allogen stamcelletransplantasjon innebærer at stamceller fra blod eller benmarg overføres fra en frisk giver til en syk pasient, for å helbrede sykdommen og gjenopprette et friskt blod- og immunsystem. Denne behandlingen står sentralt ved flere alvorlige sykdommer, særlig akutt blodkreft (leukemi). I Norge transplanteres om lag 150 pasienter hvert år, fordelt på 2 transplantasjonssentre i hhv. Oslo (Rikshospitalet) og Bergen (Haukeland Universitetssykehus). Hos mange av pasientene oppstår komplikasjonen transplantat-mot-vert sykdom (ofte forkortet GVHD, for ´graft-versus-host disease´), hvor cellene fra giveren setter i gang en skadelig - og i verste fall dødelig immunreaksjon hos pasienten. Slike reaksjoner behandles vanligvis med steroidmedikamenter, og hvis disse ikke virker, kaller vi sykdommen steroidrefraktær. Dette er ofte svært alvorlig, ettersom andre behandlingsmuligheter er begrenset og effekten uforutsigbar. Vårt prosjekt undersøker blodceller fra transplanterte pasienter over tid med metoden massecytometri, som gir en unik mulighet til å måle nesten 50 ulike molekyler inni – og utenpå den enkelte celle, samtidig. Vi ønsker også å kartlegge enkeltcellers genuttrykk samt viktige signalproteiner (cytokiner) i blodet til de samme pasientene, og se på sammenhengen mellom de ulike måleresultatene. Dette kan gi mer detaljert kunnskap om de biologiske prosessene ved stamcelletransplantasjon, med fokus på GVHD og behandlingseffekter. I neste omgang håper vi dette kan bidra til utvikling av nye biomarkører og behandlingsprinsipper. Prosjektets fremdrift har vært påvirket og forsinket av bl.a. COVID-pandemien, men arbeidet med innsamling av pasientprøver er videreført også siste år. I tillegg er det gjennomført ytterligere testing av vårt analysepanel for massecytometri, også på et utvalgt mindre antall pasientprøver sammenlignet med prøver fra friske frivillige. Dette har etter grundig gjennomgang gitt grunnlag for enkelte mindre justeringer med sikte på optimalisering av panelet, i nært samarbeid med våre internasjonale samarbeidspartnere, især i Bonn, Tyskland. Vi har også fortsatt med testing og tilpasning av programvare og dataverktøy for analyse og bearbeidelse av resultater, bl.a. ved reanalyse av tidligere pilotdata. Undersøkelse av større mengder nøye utvalgte pasientprøver er nå under detaljert forberedelse, og vi legger i tillegg opp til å kunne bruke vårt analysepanel som grunnlag for massecytometri også på vevsprøver fra stamcelletransplanterte pasienter.

Enkeltcelleanalyser ved transplantat-mot-vert sykdom (GVHD)Det siste året har vi innhentet blodprøver fra pasienter i inn- og utland for å gjennomføre enkeltcelleanalyser med sikte på å bedre forståelsen av sykdomsprosessen bak GVHD, samt å kartlegge behandlingseffekter, med særlig fokus på steroidrefraktær sykdom. Med dette formål har analysemetodene våre også gjennomgått ytterligere utvikling og testing.Allogen stamcelletransplantasjon innebærer at stamceller fra blod eller benmarg overføres fra en frisk giver til en syk pasient, for å helbrede sykdommen og gjenopprette et friskt blod- og immunsystem. Dette er en viktig behandlingsmetode ved flere alvorlige sykdommer i blod- og immunsystemet, og særlig ved akutt blodkreft (leukemi). Det gjøres omlag 140 slike transplantasjoner årlig i Norge, fordelt på 2 transplantasjonssentre lokalisert i Oslo (Rikshospitalet) og Bergen (Haukeland Universitetssykehus). Behandlingen er svært virksom, men også meget risikabel, og hos mange av pasientene oppstår komplikasjonen transplantat-mot-vert sykdom (konvensjonelt forkortet GVHD, for ´graft-versus-host disease´), hvor de overførte cellene setter i gang en immunreaksjon som skader pasientens organer og vev. Dette kan gi betydelige plager og i verste fall være dødelig. Behandlingen er som regel steroidmedikamenter, og når disse ikke virker kaller vi sykdommen steroidrefraktær. Årsakene til dette er lite kjent, behandlingsmulighetene er begrenset, og slike pasienter har en særlig dårlig prognose. I dette prosjektet undersøkes blodceller fra transplanterte med metoden massecytometri, som gir en unik mulighet til å måle nesten 50 ulike molekyler inni – og utenpå den enkelte celle samtidig, ved hjelp av svært presise "merkelapper" bestående av målrettede antistoffer bundet til helt unike metallisotoper. Samtidig ønsker vi å undersøke enkeltcellers genuttryk ved hjelp av RNA-sekvensering, samt å sammenholde informasjonen om cellenes egenskaper med målinger av viktige signalproteiner (cytokiner) oppløst i blodet (serum) til de samme pasientene. På denne måten håper vi å få langt mer detaljert kunnskap både om sykdommen GVHD i seg selv og om hvordan behandling virker, hvilket i neste omgang kan bidra til utvikling av nye biomarkører og behandlingsprinsipper. Det siste året har COVID-pandemien fortsatt å medføre betydelige forsinkelser i prosjektets fremdrift både mhp. laboratoriearbeid og annen samhandling. Perioden har i all hovedsak vært dedikert til videreutvikling og testing av vårt spesialtilpassede antistoffpanel for massecytometri. Ettersom andre forskningsresultater har gitt grunnlag for å rette fokus mot enda flere cellulære bestanddeler, samtidig som nye metallisotoper har blitt tilgjengelig, har vi blitt i stand til å utvide panelet vårt med en rekke relevante markører. Det utvidete panelet er deretter testet og tilpasset for å kunne fungere optimalt til vårt formål. I tillegg er det gjennomført ytterligere innsamling og omfattende forsendelser av pasientprøver i nært samarbeid med våre internasjonale samarbeidspartnere, særlig i Bonn, Tyskland. Dette har resultert i at vi endelig har tilgjengelig et stort antall pasientprøver for analyse. Vi forbereder nå disse analysene i detalj, inklusiv optimalisering av prøvesammensetning samt grundig gjennomgang og tilpasning av dataverktøy for håndtering og bearbeidelse av de enorme mengdene flerdimensjonale data som vil bli generert.

Enkeltcelleanalyser ved akutt transplantat-mot-vert sykdom (aGVHD)Effekten av konvensjonell behandling mot aGVHD er begrenset, og gjennom enkeltcelleanalyser håper vi både å kunne bedre forståelsen av bakenforliggende biologi samt å bidra til utvikling av nye biomarkører og behandlinger. Vi har siste år gjennomført prøveinnsamling, metodetilpasning samt detaljerte forberedelser til pasientanalyser.I dette prosjektet samles for tiden blod til enkeltcelleanalyse fra leukemipasienter som gjennomgår allogen stamcelletransplantasjon, dvs. transplantasjon av blodstamceller fra et annet individ. Akutt transplantat-mot-vert sykdom ('acute graft-versus-host disease' - aGVHD) oppstår hos omlag halvparten av disse pasientene, og skyldes en immunreaksjon fra de tilførte cellene mot mottakers organer og vev. Dette kan i verste fall være dødelig, og medfører ofte betydelig redusert livskvalitet. Vi ønsker å sammenligne pasienter som utvikler aGVHD med pasienter uten aGVHD, og i tillegg med friske kontrollpersoner. Særlig fokuserer vi på pasienter som ikke har effekt av standard behandling med steroider, siden disse pasientene har ekstra dårlig prognose og høy dødelighet. Prøveinnsamlingen pågår både i Bergen og hos samarbeidspartnere i utlandet. Det er også samlet prøver som ledd i HOVON-145/ETAL-4 studien, som undersøker bruk av medikamentet panobinostat hos transplanterte pasienter. Blodceller fra prøvene vil bli analysert med massecytometri, hvor både overflatemolekyler og signalveier inni cellene kan kartlegges samtidig hos den enkelte celle. Dette skjer via binding av spesifikke monoklonale antistoffer konjugert til unike metallisotoper, som skilles fra hverandre vha. massespektrometri. En pålitelig analyse krever nøye tilpasning av både antistoffer og tilhørende isotoper, og mye tid har siste året vært brukt til finjustering (titrering) av vårt eget antistoffpanel på prøver fra friske kontrollpersoner. Vi venter også på forsendelse av pasientprøver fra utlandet, og begge disse prosessene har blitt betydelig forsinket av den pågående COVID-pandemien. Imidlertid er titreringsanalysene nå i en sluttfase, og det foreligger omsider konkrete planer for prøveforsendelse, slik at pasientanalyser ventelig kommer godt i gang tidlig i 2021. Det er også planlagt massecytometrisk undersøkelse av vevsprøver hos utvalgte pasienter, og vi ønsker i tillegg å undersøke hvilke gener som er uttrykt i den enkelte blodcelle vha. RNA-sekvensering. Vi har dessuten etablert et samarbeid med St. Olavs Hospital mhp. analyse av signalproteiner (cytokiner) i blod, som vil gi viktig tilleggsinformasjon om sykdomsprosessen. Til slutt håper vi at de ulike metodene sammen vil gi oss et unikt innblikk i sykdomsbiologien som på sikt kan komme direkte til nytte for pasientene både innen forebygging, diagnostikk og behandling av aGVHD.

Mot en bedre forståelse av transplantat-mot-vertsykdom på enkeltcelle-nivåAkutt transplantat-mot-vertsykdom (aGVHD) er en av de viktigste årsakene til behandlingssvikt hos stamcelletransplanterte pasienter. I dette prosjektet undersøkes nå detaljerte egenskaper ved enkeltceller fra slike pasienter med sikte på å bedre forståelsen - samt behandlingen av denne sykdommen.Akutt transplantat-mot-vertsykdom (´acute graft-versus-host disease´ - aGVHD) er en vanlig og fryktet komplikasjon etter allogen stamcelletransplantasjon (transplantasjon av blodstamceller fra et annet individ), en behandling som brukes for å kurere dødelige blodsykdommer, blant annet akutte leukemier. Sykdommen skyldes en immunreaksjon fra de tilførte cellene mot mottakerens organer. AGVHD kan ofte forebygges, men hos pasientene som likevel utvikler sykdom, har kun halvparten god nok effekt av standard behandling med steroider alene. Effektive behandlingsalternativer er dessuten begrenset, og kunnskapen om hvilke mekanismer som gjør at sykdommen utvikles er også mangelfull. Vi tror at detaljert undersøkelse av enkeltceller, fortrinnsvis immunceller, kan gi oss mer kunnskap om både sykdommen i seg selv og især om hvorfor behandling virker eller ikke virker. Til dette bruker vi i dette prosjektet metoden massecytometri, som gir en unik mulighet til å undersøke enkeltcellers egenskaper i over 40 ulike dimensjoner ved hjelp av antistoffer bundet til tungmetaller. Vi har nå ferdigstilt utviklingen av et panel av slike antistoffer som er i stand til å skille ulike celletyper fra hverandre med stor nøyaktighet, i tillegg til å analysere hvilke signalveier som er slått på eller av, m.a.o. hva den enkelte celle foretar seg. Antistoffpanelet er utformet i fellesskap med samarbeidspartnere i Norge og Tyskland, og det samles fortløpende inn blodprøver fra stamcelletransplanterte pasienter fra flere sentre i Norge, Tyskland og Nederland for å kunne få nok materiale til å kunne uttale oss om de nevnte problemstillingene. Vi har også laget egne antistoffer bundet til tilpassete metaller skreddersydd til akkurat dette prosjektet, hvor undersøkelse av cellenes funksjon står særlig sentralt. For tiden arbeider vi med testing og innkjøring av disse antistoffene på prøver fra friske kontrollpersoner, og er på vei til å starte analysene av pasientprøver. Vi ønsker også å undersøke om ulik håndtering av blodprøvene kan ha betydning for resultatene, og samler derfor prøver på flere måter for en del av pasientene. Det siste året har vi i tillegg fått mulighet til å analysere vevsprøver med samme metode som brukes på blod, såkalt bilde-massecytometri, og vi planlegger å bruke også denne metoden på pasientprøver, ettersom slike vevsprøver står svært sentralt i diagnostikken av aGVHD. Derfor er et tilpasset antistoffpanel for dette formål også under utvikling, og videre arbeider vi med å utvide studien til også å analysere hvilke gener som er uttrykt i den enkelte celle. Forhåpentligvis vil dette samlet gi opphav til resultater som kan bidra til å bedre leveutsikter og livskvalitet etter stamcelletransplantasjon.

Towards understanding how single cells behave in acute graft-versus-host disease (aGVHD)Acute graft-versus-host disease (aGVHD) is a major serious and potentially fatal complication of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). In this project, blood cells from transplant recipients at multiple centers are now being collected for single cell analysis with our newly designed mass cytometry panel.Despite continuing advances in prophylaxis and supportive care, roughly half of transplanted patients still suffer from aGVHD, limiting the success of this potentially life saving treatment. Of these, only about 50% have a durable response to first line treatment with corticosteroids, and steroid-refractory patients have a particularly dismal prognosis. Important reasons for this have been the limited availability and success of second line therapy, as well as the considerable side effects and mortality associated with such treatments, which are largely based on suppressing the immune system. Although promising new therapeutic principles are emerging, notable small molecular inhibitors like Ruxolitinib and Ibrutinib targeting specific signaling pathways inside immune cells, antibodies like Vedolizumab interfering with immune cell trafficking and adhesion and extracorporeal photophoresis (ECP) whose mechanism of action is largely unknown, the mortality in steroid-refractory disease is still unacceptably high. Furthermore, our knowledge of the biology of aGVHD and steroid refractoriness is very limited and fragmented, and much of what we know is based on animal studies. Research on cellular processes over time in real patients is scarce. This project aims to address these issues by examining blood cells from patients at several time points before and after transplantation, using the technique of mass cytometry. This technology has a unique ability to simultaneously measure a large number of molecules and processes in single cells at high resolution by means of metal-tagged antibodies and time-of-flight mass spectrometry. During this past year, we have established procedures for the sampling, processing and storage of blood cells at several centers, and sample collection is currently ongoing. We are steadily increasing the number of participating centers internationally, and are currently also in the process of securing blood sample collection for mass cytometry in the multicenter ETAL-4/HOVON-145 trial, where high-risk patients with acute myeloid leukemia (AML) and myelodysplastic syndromes (MDS) are treated with the drug Panobinostat after HSCT. Based on preliminary analyses of pilot samples from patients with acute myeloid leukemia (AML), we have now designed the first complete mass cytometry antibody panels, which will form the cornerstones for further analyses. These will also serve as backbones for additional experimental developments, expanding the scope of molecular pathways analyzed, with a special focus on intracellular signaling, thus addressing recent data indicating a redundancy of cellular responses to extracellular stimuli and danger signals in aGVHD. We are also still continuously working on optimizing sample acquisition and processing, to be able to preserve the cellular molecules as intact as possible throughout the analytic pipeline. Finally, a new instrument for imaging mass cytometry has recently been installed in Bergen, allowing for mass cytometric analysis also of tissue slides, providing the opportunity to apply our analytic principles directly to cells in the target tissues of aGVHD, where the inflammation and organ damage actually takes place. Based on analyses using a finalized mass cytometry panel, we will prepare an abstract for the American Society of Hematology (ASH) Annual Meeting 2019.

Understanding acute graft-versus-host disease (aGVHD) on a single cell levelAround half of the patients undergoing allogeneic stem cell transplant still suffer the potentially fatal and often debilitating complication of graft-versus-host disease. This research project aims to unveil the mechanisms underlying this disease, studying how single blood cells behave in leukemia patients before and shortly after transplantation.A minor proportion of patients with acute graft-versus-host disease do not respond to first-line treatment with corticosteroids. These patiens have an adverse prognosis with a limited survival probability, and their quality of life is often severely impaired. Traditional second-line drug therapy has shown limited evidence of predictable effect in this situation, but novel treatments are showing some promise, notably Vedolizumab and small molecular inhibitors like Ruxolitinib and Ibrutinib. In addition, extracorporeal photophoresis (ECP) in which white blood cells are treated with ultraviolet light, is proving highly effective in some steroid-refractory patients. This procedure was established at Haukeland University Hospital in December 2017, as recently featured in the regional newspaper (BT.no). The conditional success of such therapies could provide important clues to the causes and mechanisms of graft-versus-host disease, and this has been an important inspiration for elaborating this research project, where peripheral blood from adult patients with acute myeloid leukemia is currently being collected at regular intervals before and shortly after stem cell transplant. Blood cells are then analysed in batches by the highly multiparametric method of mass cytometry, where surface molecules and intracellular markers can be simultaneously measured and accurately characterized on a single cell level by means of metal-tagged monoclonal antibodies. The PhD project was officially initiated on July 1st 2017, and the year has seen advanced coursing on applied mass cytometry and analytical methodology in London and in Bergen, as well as elaboration of the first antibody-panel for analysis of patient samples. This includes both intra- and extracellular targets, and application on preliminary pilot samples shows involvement of distinct immune cell subsets in patients with acute GVHD. Moreover, we have seen signs of selective intracellular signaling changes in patients with steroid-refractory disease. This will form the basis of further panel refinement, which includes tailoring of specific metal-tagged probes for targeted analysis. Sampling of patients is currently ongoing in Norway and in Germany, and we are now actively recruiting even more centers for sampling of pilot material, aiming at inclusion of in total 100-200 pilot patients within the next 18-24 months. Subsequently, we will further expand the scope of the study, including bone marrow and tissue samples. Standard operating procedures (SOPs) are under elaboration, allowing for highly standardized sample handling, preparation and shipping between centers. Small batches of material from patients and controls is being regularly analysed by mass cytometry to ensure adequate sample quality, as well as for validating analytical protocols and panels. We are also setting up substudies on different sampling procedures, to minimize possibilities of results being biased by the way blood is handled or prepared at different sites. Furthermore, on the basis of our pilot analyses, Bergen has been trusted with the responsibility of mass cytometry analysis in a large multicenter European trial on Panobinostat in post-transplant patients, HOVON-145, and aim to participate also clinically. In addition, we will collaborate with Oslo on ECP-studies, and on the basis of pilot results, a draft for an abstract for the EHA Annual Congress 2018 is being prepared together with our research partners in Bonn.