Molekylærbiologisk studie av FKRP-relatert Limb Girdle Muskeldystrofi (LGMD type 2I).

Molekylærbiologisk studie av FKRP-relatert Limb Girdle Muskeldystrofi (type 2I)Limb-Girdle muskeldystrofi (LGMD) er en gruppe arvelige, progressive myopatier som primært rammer de store proksimale muskelgrupper – skuldre, overarmer, bekken og lår. LGMD type 2I, som skyldes mutasjoner i FKRP genet (FuKutin Relatert Protein), utgjør den største gruppen av LGMD pasienter i Norge (minimum prevalens >1/54000). I dette prosjektet søker vi å identifisere og karakterisere FKRPs rolle i muskelcellen, ved bruk av tradisjonelle og nye molekylærbiologiske metoder.Inngående kunnskap om årsaksforhold på molekylært nivå er nødvendig for diagnostikk og fremtidig behandling av LGMD2I. Det er tidligere vist at pasienter med LGMD2I har mangelfull glykosylering (påkobling av spesifikke sukkermolekyler) av membran/ECM-proteinet, alfa-dystroglycan (DAG1). Disse sukkermolekylene forankrer muskelcellene og gjør at de tåler mekanisk påvirkning/kontraksjon. Utover dette finnes det ingen kunnskap om FKRPs cellulære funksjon og biologiske rolle. Sentrale spørsmål er derfor: 1) Hvor i muskelcellen er FKRP lokalisert? 2) Hva er FKRPs funksjon? 3) ”Samarbeider” FKRP med andre komponenter i muskelcellen - i så fall hvilke? Vi har etablert relevante teknikker og metoder samt utviklet anti FKRP-antistoffer og cellekultursystemer for studier av intracellulær lokalisering og biologisk aktivitet. Vi ønsker videre å isolere FKRP-assosierte proteinkomplekser fra muskel, identifisere ulike komponenter, studere støkiometri og interaksjonsspesifisitet samt gjøre komparative biokjemiske studier ved å benytte pasientmateriale og normalmateriale (muskelbiopsier). Intracellulær lokalisering: Ved bruk av elektronmikroskopi i kombinasjon med anti FKRP-antistoffer og sekundære gullmerkede antistoffer har vi lokalisert FKRP spesifikke signaler i ultratynne snitt fra muskel. Foreløpige resultater tyder på at FKRP er lokalisert til Golgiapparatet, nær Z-linjene, mellom myofibrillene i muskelcellene. FKRPs funksjon og rolle i biokjemiske ”pathways”: I samarbeid med Universitetet i Lille, Frankrike, har vi testet metoder for å anrike og måle glykosylerings-produkter (typer av store sukkermolekyler) i muskelvev. Metodene vil bli benyttet for å studere komposisjon av sukkermolekyler i muskel fra LGMD2I pasienter for sammenligning med normalt muskelvev. Disse studiene følges opp ved bruk av celler i kultur som uttrykker rekombinant alfa-dystroglycan i fravær og i nærvær av rekombinant FKRP, der glykosylerte varianter av alfa-dystroglycan kan renses og analyseres ved massespektrometri (MS). FKRP og interagerende proteinpartnere: Vi har utført kjemiske kryssbinding av FKRP (in vivo og in vitro), kombinert med Western blot analyse. Resultatene indikerer at FKRP danner en homo-di-mer samt at den inngår i kompleks med andre proteiner i muskel-cellen. I samarbeid med Hybrigenics, Paris, Frankrike har vi utført såkalte Gjær-to-hybrid analyser (Y2H). Fire høysignifikante FKRP interaksjonsproteiner ble identifisert. Et av disse proteinene er involvert i en annen form for LGMD, MD/EB. FKRP-assosierte proteiner undersøkes nå videre ved bruk av biokjemiske metoder. Spesielle mutasjoner i FKRP genet gir mer alvorlige sykdommer slik som Walker-Warburg Syndrom (WWS), Muscle-Eye-Brain disease (MEB) og Kongenital muskeldystrofi type 1C. Kunnskap om FKRPs struktur og funksjon vil derfor kunne gi oss muligheten til å forstå årsaken, ikke bare til LGMD2I, men også den store kliniske variasjonen blant pasienter med mutasjoner i FKRP genet.