Investigation into some genetic aspects of preeclampsia: Role of Laeverin in the pathophysiology of preeclampsia and genome copy number variations in maternal and umbilical cord blood

Prosjektnummer: SFP1099-13
Ansvarlig person: Ganesh Acharya
Institusjon: Universitetssykehuset Nord-Norge HF
Prosjektkategori: Ph.d.-stipend
Helsekategori: Reproductive health and childbirth
Forskningsaktivitet: 1. Underpinning, 4. Detection and Diagnosis

2018 - sluttrapport

Laeverin is a membrane-bound aminopeptidase mostly expressed in the placenta. Significant (10-fold) upregulation of laeverin mRNA was seen in preeclamptic placentas in our previous study. Therefore, we aimed to investigate the possible role of laeverin in the pathophysiology of preeclampsia in this PhD project. In the first study, we used immunofluorescence microscopy to compare the expression of laevarin between healthy and preeclamptic third trimester placentas. We found that laeverin protein is expressed in cell membrane of villous trophoblasts in healthy placentas, whereas in preeclamptic placentas it was expressed ectopically in the cytoplasm, especially in microvesicles. Immunoelectron microscopy showed laeverin leakage into the fetal capillaries and abundant expression in microvesicles in preeclamptic placentas. Laeverin gene-silencing caused a reduction in migration and invasion capacity of first trimester trophoblast cells (HTR-8/SVneo). Pathway analysis using PCR-array and laeverin-silencing demonstrated significant downregulation of integrin A2 (39-fold), integrin B3 (5-fold), and matrix metalloprotease 1 (36-fold), indicating possible downstream effects of laeverin at the molecular level. In the second study, we further investigated the expression of laeverin in placental tissue, and maternal and fetal blood samples. Enzyme-linked immunosorbent assay analysis of laeverin protein in maternal blood showed decreasing laeverin concentration with advancing gestational age during the second half of normal pregnancy. Moreover, we found that lower levels of laeverin in the maternal plasma measured at 22–24 weeks might be associated with the development of preeclampsia later in gestation. In the third study, we performed tissue microarray analysis to investigate differences in laeverin protein expression between healthy and preeclamptic placentas. Immunohistochemistry showed that laeverin was expressed in syncytiotrophoblasts, cytotrophoblasts and extravillous trophoblasts in all placentas. All placental samples that showed cytoplasmic expression of laeverin were from women who had early-onset preeclampsia. Further, immunofluorescence studies demonstrated that cytoplasmic expression of laeverin expression is more common in preeclamptic compared to normal placentas. In summary, we demonstrated that laeverin has a role in human placentation and possible implications in the pathophysiology and clinical manifestation of preeclampsia. PhD candidate defended her thesis in 2018. The project has resulted several other publications and presentations in addition to 3 articles included in the thesis. It has also led to further international collaboration. One study conducted in Denmark in collaboration with our group showed that maternal serum laeverin concentration measured in the early first trimester does not predict development of preeclampsia later in pregnancy. This project has improved our understanding of pathophysiology of preeclampsia. Our studies have demonstrated that despite playing a role in the development and manifestation of this pregnancy specific condition, laeverin on its owns unlikely to be useful as a biomarker for screening preeeclampsia.

Beskriv samarbeidet med brukerrepresentanten(e) det siste året

ikke relevant

2017

SFP1099-13: Investigation into some genetic aspects of preeclampsia: Role of Laeverin in the pathophysiology of preeclampsia.Tidligere har vi funnet høy laeverin gen mRNA ekspresjon i morkakevev av kvinner med preeklampsi. I dene studien planlegger vi å studere ekspresjon av laeverin protein i placenta og mors blod hos gravide kvinner med og uten preeklampsi.Stipendiaten er i sluttfasen av prosjektet og vil disputere våren 2018. Alle formelle opplæringskrav er fullført, to artikler er publisert i vitenskapelig tidsskrift og den tredje artikkelen er akseptert for publikasjon.Tredje artikkel kalt "Laeverin Protein Expression in Normal and Preeclamptic Placentas using Tissue Microarray Analysis" er akseptert for publikasjon i Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica (AOGS). Den er en studie hvor en ny metode kalt tissuemicroarray (TMA) analyse er benyttet til å analysere placentavev fra 33 preeklampsi-pasienter og 39 normale svangerskap ved immunohistokjemi og immunofluorescens med antistoffer rettet mot laeverin og en trofoblastcellemarkør (cytokeratin 7 (CK7). I immunhistokjemi-studien fant vi laeverin uttrykk i alle trofoblastcelletyper (syncytiotrofoblaster, cytotrofoblaster og ekstravilløse trofoblaster i alle placentaer ved bruk av TMA. I placenta med preeklampsi (n=33) sammenlignet med normale placenta (n=39), fant vi laeverin uttrykk i cellemembranen i 21 (64%) vs 21 (54%) av prøver undersøkt (p=0.726), i cytoplasma i 3 (9%) vs 2 (5%) av prøver undersøkt (p=0.795) og i både cytoplasma og cellemembran i 9 (27%) vs 16 (41%) av prøver undersøkt (p=0.0522). Alle placentaprøver som viste cytoplasmisk laeverinuttrykk var fra kvinner med forløsning før uke 34 av svangerskapet (tidlig-onset preeklampsi). Immunflurescens studier viste laeverinuttrykk i cytoplasma av 6 preeklampsiske (3 tidlig-onset and 3 sein-onset) og 1 normal placenta, men viste ingen samtidig ekspresjon av laeverin i cellemembran og cytoplasma uttrykk av laeverin. Kandidaten har skrevet ferdig utkast av avhandlingen og disputas dato er satt til 11 mai 2018. Hun har vært en aktiv bidragsyter i paneldebatter, folkemøter og i dagspressen om fosterdiagnostikk. Kandidaten fikk mentorprisen for 2017 fra Norsk Selskap for Medisinsk Genetikk.

2016

Investigation into some genetic aspects of preeclampsia: Role of Laeverin in the pathophysiology of preeclampsiaStipendiaten er i sluttfasen av prosjektet og vil disputere 2017. Alle formelle opplæringskrav er fullført og to artikler er publisert i vitenskapelig tidsskrift.Tidligere har vi funnet høy laeverin gen mRNA ekspresjon i morkakevev av kvinner med preeklampsi. I dene studien planlegger vi å studere ekspresjon av laeverin protein i placenta og mors blod hos gravide kvinner med og uten preeklampsi. PhD stipendiaten var finansiert av Helse-Nord. Stipendiaten har ikke hatt mulighet til å disputere i 2016 pga alvorlig sykdom og dødsfall i nær familie. Det er imidlertid publisert 2 artikler som skal gå i avhandlingen (Nystad M, Sitras V, Larsen M, Acharya G.Placental expression of aminopeptidase-Q (laeverin) and its role in the pathophysiology of preeclampsia.Am J Obstet Gynecol. 2014 Dec;211(6):686.e1-31. doi: 10.1016/j.ajog.2014.06.047. Nystad M, Sitras V, Flo K, Widnes C, Vårtun Å, Wilsgaard T and Acharya G: Longitudinal reference ranges for maternal plasma laeverin, and its role as a potential biomarker of preeclampsia. BMC Pregnancy and Childbirth 2016 16:377. DOI 10.1186/s12884-016-1156-9). Stipendiaten har skrevet et utkast av avhandlingen. I tillegg har hun gjort «tissue microarray» (TMA) analyser med laeverin-antistoff på placentaer fra normale svangerskap og fra kvinner med preeklampsi. Det er gjort immunhistokjemi (IHC)- og immunfluorescens (IF) studier, for å avdekke forskjeller i uttrykk av laeverin i normale- og svangerskap med preeklampsi. Stipendiaten holder på med å analysere data og skrive på manuset av artikkel 3. I tillegg har kandidaten publisert følgende artikkel og bokkapittel: • El-Gewely MR, Andreassen M, Walquist M, Ursvik A, Knutsen E, Nystad M, Coucheron DH, Myrmel KS, Hennig R, Johansen SD: Differentially Expressed MicroRNAs in Meningiomas Grades I and II Suggest Shared Biomarkers with Malignant Tumors. Cancers. 2016, 8(3), 31; doi 10.3390/cancers8030031. • Klingenberg C, Smeland M og Nystad M: Genetiske analyser. Metodebok i nyfødtmedisin UNN. 2016 Stipendiaten har i også deltatt på «Snakk med en forsker» på Institutt for Medisinsk Biologi (IMB), UiT Norges Arktiske Universitet, 29.09.16 for å promotere forskningen med tema «Preeklampsi og genetikk». Stipendiaten har rekruttert 2 Bachelorstudenter som hun skal veilede sammen med professor Purusotam Basnet.

2015

Investigation into some genetic aspects of preeclampsiaTidligere har vi funnet høy laeverin gen mRNA ekspresjon i morkakevev av kvinner med preeklampsi. I dene studien planlegger vi å studere ekspresjon av laeverin protein i placenta og mors blod hos gravide kvinner med og uten preeklampsi. Stipendiaten er i sluttfasen av prosjektet og vil disputere i 2016.Tidligere har vi funnet høy laeverin gen mRNA ekspresjon i morkakevev av kvinner med preeklampsi. I dene studien planlegger vi å studere ekspresjon av laeverin protein i placenta og mors blod hos gravide kvinner med og uten preeklampsi. Stipendiaten er i sluttfasen av prosjektet og vil disputere i 2016. Det har vært tilfredstillende progresjon i prosjektarbeidet. En artikkel ble publisert in 2014 i et nivå 2 tidsskiftet (Am J Obstet Gynecol). I 2015 har stipendiaten arbeidet med biomarkøranalyse av laeverin i serum- og plasmaprøver. Dette arbeidet har munnet ut i en artikkel med tittelen: "Longitudinal reference ranges for maternal plasma laeverin, and its role as a potential biomarker of preeclampsia". Den er sendt inn til BMC Pregnancy and Childbirth for referee vurdering. Sekvensering av laeverin-genets 20 ekson og intron-ekson overganger er nesten ferdig. Det arbeides med tissue microarray analyser (TMA) av normale placentaprøver og prøver fra placenta fra kvinner med preeklampsi. Stipendiaten deltok på konferanse: Genomics in current clinical practice og på Nasjonalt genetikkmøte i Bergen og ledet workshop om fosterdiagnostikk i november 2015. I tillegg har kandidaten deltatt med innlegg (med tittelen "Pasientnær forskning kan redde mor og barn") i en nasjonal forskningskampanje kalt Hjernekraftkampanjen på Facebook i regi av Forskningsforum . Kandidaten har publisert en kronikk (Nystad M (2015): “Byen med de gode tankene” Forskerforum 1:41) i 2015. Stipendiaten har bestått siste eksamen i "Correlative Light and Electron Microscopy" (CLEM) MBI-8003 V-2015 og obligatorisk gel av PhD utdanning er ferdig. Skriving av avhandlingen er påbegynt. Avhandlingen planlegges innlevert våren 2016.

2014

Investigation into some genetic aspects of preeclampsia: Role of Laeverin in the pathophysiology of preeclampsiaWe reported previously that the mRNA levels of laeverin gene are significantly up-regulated in preeclamptic compared to healthy placentas. In this study we plan to investigate the expression of Laeverin at the protein level in placenta, maternal blood and umbilical cord blood in normal and preeclamptic human pregnancies.Preeclampsia is a pregnancy-specific syndrome characterized by hypertension and proteinuria that complicates 5-10% of pregnancies. Laeverin (aminopeptidase-Q) is a plasmamembrane-bound aminopeptidase that is specifically expressed in the human placenta. We reported previously that the mRNA levels of laeverin gene are significantly up-regulated in preeclamptic compared to healthy placentas, indicating that laeverin might play a role in the pathophysiology of preeclampsia. In this study we plan to investigate the expression of Laeverin at the protein level in placenta, maternal blood and umbilical cord blood in normal and preeclamptic human pregnancies, and its role in trophobast cell function using in vitro studies. For the purpose of this study we are using placental samples and blood samples stored in the biobank. We are using molecular biological techniques including tissue microarray, EISA, immuno-histochemistry, RT-PCR, Western blot, immunoelectronmicroscopy, cell culture and in vitro invasion/migration assays to investigate the expression levels and function of Laeverin in normal and pathological condition, i.e. preeclampsia. We plan to evaluate the possibility of using Laeverin as a diagnostic/prognostioc biomarker of preeclampsia in future. The studies are in progress and the PhD student has already completed all the obligatory courses and study requirements. One article is published in a level II journal. Data have been analysed for the second article that will provide gestational age specific longitudinal reference ranges for Laeverin in the second half of pregnancy. The manuscript writing is under progress. Blood samples from preeclamptic women and their matched controls have been analysed for Laeverin levels, and tissue microarray studies on placental samples are being performed in collboration with Oslo University Hospital. This material will provide necessary data for the third article. We expect that the candidate will complete and defend her thesis within one year.

2013

Investigation into some genetic aspects of preeclampsiaRole of Laeverin in the pathophysiology of preeclampsia and genome copy number variations in maternal and umbilical cord bloodPreekampsi er et syndrom som affiserer 3-8% av graviditeter og kan gi perinatal og maternell morbiditet og mortalitet på verdensbasis. Etiologien er ikke kjent. I en tidligere studie har vi funnet at 16 gener kan predikere preeklampsi i vår studiepopulasjon. Laeverin er et av disse genene, som er uttrykt i ekstravilløse trofoblaster og er 10-fold oppregulert i placenta hos kvinner med preeklampsi. Ufullstendig placentering med dårlig trofoblastinvasjon i maternell decidua, under første trimester av graviditeten, er en hypotese bak pathogenesen av preeklampsi. Vi har studert laeverins rolle i celleinvasjon og migrasjon ved å gjøre "siRNA-silencing" forsøk i en trofoblastcellelinje. Vi har vist at laeverin er involvert i migrasjon og invasjon av trofoblastceller. I tillegg har vi studert laeverins proteinuttrykk i placenta fra kvinner med preeklampsi og placenta fra friske kvinner. Proteinet finnes normalt sett i trofoblastcellers plasmacellemembran, mens i placenta fra kvinner med preeklampsi er proteinet uttrykt i trofoblastcellers cytoplasma, nærmere bestemt i mikrovesikler. Problemstillingen i vår studie er: 1) Avklare hvilken rolle laeverin har i placentautvikling og funksjon 2) Helgenom molekylær karyotypering av mødre med preeklampsi, deres foster og trofoblastceller Stipendiaten ble ansatt i februar 2013 og har kommet godt igang med prosjektet. Hun har gjort Western blot analyse, immunhistokjemi, elektronmikroskopiering og cellearbeid i denne perioden. En artikkel er sendt inn til tidsskriftet (Hypertension) for vurdering. Stipendiaten har presentert en poster på ISSHP European Congress. Et abstrakt er publisert i tidsskriftet: Transmission electron microscopy reveals leakage of laeverin into the villous capillaries and ectopic expression in the cytoplasm instead of cell membrane of the trophoblasts in preeclmptic placentas. Pregnancy Hypertension 2013; volume 3 (No2) pp77. Hun har god progresjon i den obligatoriske delen av opplæringen (med totalt 14 studiepoeng). Stipendiaten fortsetter med laboratoriearbeid for å ferdigstille analyser for artikkel 2 og 3.

Vitenskapelige artikler

Pihl K, Sørensen S, Nystad M, Acharya G, Jørgensen FS

Maternal serum laeverin (aminopeptidase Q) measured in the first trimester of pregnancy does not predict preeclampsia.

J Matern Fetal Neonatal Med 2018 Apr 22. Epub 2018 apr 22

PMID: 29681208

Nystad M, Sitras V, Nordbakken CV, Pedersen MI, Acharya G

Laeverin protein expression in normal and preeclamptic placentas using tissue microarray analysis.

Acta Obstet Gynecol Scand 2018 May;97(5):536-544. Epub 2018 feb 15

PMID: 29355889 - Inngår i doktorgradsavhandlingen

Acharya G, Aplin J, Brownbill P, Bulmer J, Burton G, Chamley L, Chernyavsky I, Clark A, Collins S, Cottrell E, Dilworth M, Elad D, Filoche M, Hannan N, Heazell AEP, Jensen O, Johnstone ED, Leach L, Lewis R, Morgan T, Myers J, Nye G, Oyen M, Salafia C, Schneider H, O'Tierney-Ginn P

IFPA meeting 2017 workshop report: Clinical placentology, 3D structure-based modeling of placental function, placental bed, and treating placental dysfunction.

Placenta 2018 Apr;64 Suppl 1():S4-S8. Epub 2017 des 15

PMID: 29273272

Nystad M, Sitras V, Flo K, Widnes C, Vårtun Å, Wilsgaard T, Acharya G

Longitudinal reference ranges for maternal plasma laeverin, and its role as a potential biomarker of preeclampsia.

BMC Pregnancy Childbirth 2016 Nov 25;16(1):377. Epub 2016 nov 25

PMID: 27887588 - Inngår i doktorgradsavhandlingen

Sitras V, Fenton C, Acharya G

Gene expression profile in cardiovascular disease and preeclampsia: a meta-analysis of the transcriptome based on raw data from human studies deposited in Gene Expression Omnibus.

Placenta 2015 Feb;36(2):170-8. Epub 2014 des 11

PMID: 25555499

Nystad Mona, Sitras Vasilis, Larsen Merethe, Acharya Ganesh

Placental expression of aminopeptidase-Q (laeverin) and its role in the pathophysiology of preeclampsia.

Am J Obstet Gynecol 2014 Dec;211(6):686.e1-686.e31. Epub 2014 jun 21

PMID: 24959655 - Inngår i doktorgradsavhandlingen

Doktorgrader

Mona Nystad

ROLE OF LAEVERIN IN THE PATHOPHYSIOLOGY OF PREECLAMPSIA

Disputert:: mai 2018
Hovedveileder:: Ganesh Acharya

Deltagere

Vasilis Sitras Prosjektdeltaker
Mona Nystad Doktorgradsstipendiat
Ganesh Acharya Prosjektleder

eRapport er utarbeidet av Sølvi Lerfald og Reidar Thorstensen, Regionalt kompetansesenter for klinisk forskning, Helse Vest RHF, og videreutvikles av de fire RHF-ene i fellesskap, med støtte fra Helse Vest IKT

Alle henvendelser rettes til eRapport, Helse Nord

Personvern - Informasjonskapsler